荧光原位杂交fish是检测阴性(荧光原位杂交技术的原理)
一、什么是荧光原位杂交有什么用
原位杂交(In Situ Hybridization)也叫原位杂交组化(in situ hybridization histochemistry, ISHH)，是一种固相分子杂交的方法，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织或细胞内特定核酸序列的方法。探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P，非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针和合成寡核苷酸探针。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记；而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸的磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。
原位杂交术可在原位检测细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达，有很高的敏感性和特异性，已成为细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是一种分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用荧光标记的单链核酸为探针，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。可用荧光标记的探针直接与染色体进行杂交从而对基因进行染色体定位。
代表性应用：
1、恶性肿瘤和病毒的诊断及鉴别诊断；
2、细胞和组织的基因表达；
3、完整的原位杂交实验解决方案。
二、荧光原位杂交与免疫荧光有什么区别
荧光原位杂交与免疫荧光的区别：
原位杂交是从分子水平检测，免疫荧光是从蛋白水平检测。
免疫荧光是利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。荧光原位杂交方法是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针和分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。
荧光原位杂交的原理：
FISH（fluorescence in situ hybridization）技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分。
免疫荧光的原理：
免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
三、荧光原位杂交的荧光原位杂交
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。探针首先与某种介导分子（reporter molecule）结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。FISH的基本原理是将DNA（或RNA）探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核。同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术.。对于利用rRNA的荧光原位杂交来说，如下原因可导致较低的荧光信号强度：
较低的细胞核糖体含量
较低的细胞周边的通透性
较低的目标序列可接触性（由于rRNA的折叠产生的构象，有些位置与rRNA分子内其他链或其他rRNA或蛋白紧密接触，从而使探针无法和目标序列杂交）
为检验细胞中的目标序列是否容易被探针杂交，及测试最佳杂交温度，可利用“克隆荧光原位杂交”（clone-FISH）进行试验：将rRNA基因结合入质粒，转化至大肠杆菌中表达，构成核糖体，再用荧光标记的探针杂交。
FISH可与流式细胞术联用，对特定荧光标记的细胞进行计数或者分离。原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点。
优点:1、荧光试剂和探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。
FISH最初用于中期染色体。从正在分化的细胞核中制备的这种染色体是高度凝缩的，每条染色体都具有可识别的形态，它们染色后将显现出特征性的着丝粒位置及染色带型。在处理中期染色体时，通过测定FISH所获得荧光信号相对于染色体短臂末端的位置（FLpter值）来进行作图。使用中期染色体的不足之处在于，由于它的高度凝缩的性质，只能进行低分辨率作图，两个标记至少分隔1Mb才能作为分开的杂交信号被分辨出来（Trask et al.，1991）。这种分辨率不足以构建有交往的染色体图谱。故此中期染色体FISH主要用于确定新标记在染色体上的大概位置，为其他更精细的作图方法做准备。一直以来，这些“其他方法”并不包括任一种FISH，但1995年后，一系列高分辨率的FISH技术已发展起来。这些技术通过改变待研究的染色体制备的性质而达到较高的分辨率。中期染色体对于精细作图来说凝缩度太高，因而我们需要选用较为伸展的染色体。有两种途径可以满足这一要求（Heiskanen et al.，1996）：机械伸展的染色体（mechanically stretched chromosome）通过改变从中期细胞核中分享染色体的方法而获得。离心产生剪切力可将染色体伸展到正常长度20倍。每条染色体仍可识别，而FISH信号作图方法与通常处理的中期染色体相同，这样，分辨率可明显提高，能够区分出相隔200~300kb的标记。非中期染色体（non-metaphase chromosome）染色体仅在中期高度凝缩，而在细胞周期的其他阶段保持天然未包装状态，有研究者曾利用前期细胞核，此时染色体凝缩程度足以区分出单个染色体。实际应用中，这种方法并无优于机械伸展的染色体之处。相比之下分裂间期（interphase）的染色体更为有用，因为分裂间期（再次细胞核分裂之间）的染色体包装程度最低。使用分裂间期的染色体，分辨率有可能达到25kb以下，但染色体形态特征消失，推动了定位探针位置所需的外部参照点。因此，该技术可在已获得染色体粗略图谱后使用，通常作为确定染色体一段小区域内一系列标记物顺序的方法。间期染色体含有去组装的全部的细胞DNA分子。为了进一步提高FISH的分辨率到25kb以下，有必要放弃完整的染色体，而使用纯化的DNA。这种方法叫做纤维-FISH（fiber-FISH），利用凝胶拉伸或分子梳理技术制备DNA，可以分辨间距小于10kb的标记。
四、荧光原位杂交技术的原理
荧光原位杂交技术的原理
荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。利用荧光染料与被研究对象（蛋白、多肽等）吸附或共价结合后其荧光特性发生改变，从而反映有关研究对象性能的信息。
荧光标记染色体的基本原理是通过标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，获得细胞内多条染色体（或染色体片段）或多种基因状态的信息。
用已知的荧光素标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
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